Metodologie Biochimiche

Anno accademico 2015/2016

Obiettivi formativi del corso

Durante questo corso, verranno fornite allo studente conoscenze   
sistematiche sulle principali tecniche impiegate nel laboratorio di biochimica.   
Le conoscenze impartite riguardano metodologie per l’identificazione, l’  
isolamento, e lo studio strutturale e funzionale delle macromolecole   
biologiche, nonché strumenti intellettuali per l'analisi dei risultati e per la   
loro descrizione.

Risultati dell'apprendimento

Le conoscenze acquisite e la capacità di utilizzarle in pratica saranno verificate attraverso un esame orale. In questa prova verrà valutata la capacità di esporre idee ed analisi con chiarezza e proprietà.

Attività di supporto

Lezioni frontali orali, con l’impiego di mezzi audiovisivi.

Sono inoltre previste visite nel laboratorio biochimico, nel corso delle quali gli studenti potranno assistere all’impiego di strumentazione di base riguardante: estrazione di proteine e DNA dalle cellule; separazione cromatografica di proteine; analisi elettroforetica di proteine e DNA; analisi spettrofotometrica di proteine.

Note

Prerequisiti: sono fortemente consigliati i corsi di base in Fisica, Chimica e  Biochimica.

Programma

Proprietà di base delle proteine correlate con le Metodologie Biochimiche: punto isoelettrico (pI) delle proteine, solubilità delle proteine in funzione del pH e della forza ionica, “unfolding” delle  proteine in presenza di agenti denaturanti  (denaturazione acida, termica e da detergenti).       
       
Frazionamento subcellulare mediante l’impiego di tecniche centrifugative.       
Strategie usate per l’isolamento e la purificazione delle proteine ottenute da fonti naturali o in forma ricombinante.       
       
Principi e applicazioni di metodologie di base dedicate alle proteine, sia a fini preparativi che analitici: tecniche spettroscopiche, elettroforetiche e cromatografiche.       
       
Anticorpi: relazione struttura-funzione e risposta immunitaria. Antigeni ed apteni. Preparazione degli anticorpi monoclonali e policlonali. Le metodologie immunochimiche: immunoprecipitazione, tecniche ELISA e Western-blotting. Cenni sull’impiego degli anticorpi a scopo diagnostico e terapeutico.         
       
Tecnologia degli enzimi. Metodi di determinazione dell’attività enzimatica. Analisi cinetica enzimatica allo stato stazionario (modello di Michaelis-Menten): determinazione di kcat, Km e kcat/Km, e correlazioni con le proprietà degli enzimi. Gli inibitori enzimatici reversibili ed irreversibili, e loro rilevanza biotecnologica (farmaci, pesticidi...). Esempi di utilizzo biotecnologico degli enzimi.       
       
I radioisotopi come traccianti biologici.       
       
Metodi di analisi delle interazioni ligando-proteina: titolazioni spettrofotometriche e fluorimetriche, tecniche centrifugative e di dialisi all’equilibrio. Metodi grafici per l’analisi delle interazioni ligando-proteina: Scatchard Plot e Hill Plot.       
       
Metodi di analisi delle interazioni proteina-proteina e DNA-proteina: tecniche basate su cromatografia di affinità, saggi di complementazione di frammenti proteici (yeast two-hybrid), co-immunoprecipitazione, cross-linking di complessi proteina-proteina e DNA-proteina (chromatin-immunoprecipitation), cromatografia ad esclusione dimensionale, elettroforesi di DNA (band shift assay). 
 
Principali metodologie usate negli studi di Proteomica.

Testi consigliati e bibliografia

Reed, Holmes, Weyers & Jones, Metodologie di base per le scienze biomolecolari, Zanichelli

Bonaccorsi di Patti, Contestabile, Di Salvo. Metodologie biochimiche, Casa editrice Ambrosiana

Orario lezioni

Appelli

	Data	Ore	Esame
	25/09/2015	13:30 - 15:30	Scritto
	27/07/2015	10:30 - 13:00	Scritto